RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体，没有目的条带，更换引物了也这样， 1.我觉得这个浓度的引物是偏高的，我50ul体系用这个可以p得很清晰了，不过引物只要设计得好引物二聚体不神马的我觉得不是问题.2.mix我也用bioteke的，25ul*2的，我觉得很好条带很亮，甚至比我用MBI的，TAKARA的都好，3.模板浓度我觉得需要摸索，模板的量和正确性也很重要.不过如果做过摸索都P不出来我觉得是你模板DNA的问题，是否验证过是正确的.4.用mix就不要再考虑mg啦，要就自己配来做条件摸索吧，不过我觉得没必要.5.我也是用primer设计oligo验证，只能说评价感觉的确不太匹配，不过在使用中我primer中评价很一般的引物我都可以做出来，我觉得这些评价软件其实也不能太做准.6.我习惯顺序是模板-引物-mix-水，我没做过20ul的，最少也25ul，而且我觉得这个问题的答案是随你便，只要混匀了先加哪个有什么关系？7.预变性5min足够了，循环中的变性以你的产物长度来说30s也够了，不过不放心可以改啊，条件是摸索出来的嘛.最后总结：我觉得引物第一，模板第二，其他神马的只要按PCR的规则随便都可以做出来，做得好不好看而已，你有没有考虑过模板物种问题？是不是没混匀？机器问题？上样问题？试剂存放时间问题，我觉得做不出来要细心地找原因.我也不是什么老手，尽我所能而已，祝你好运.
PCR结果没有条带，都是弥散的，这是为什么 首先怀2113疑，特异性不好，解5261决办法：1，可能是模4102板量过高1653，降低模板浓度10-1000倍；版2，适当提高退火温度1-3度，或权者先用高于你以往退火温度的1-3度先p上5个循环，再用先前温度p剩余的循环（也就是在程序中多设置2步）；3，稍降Mg离子浓度，如果以前加1.5ul的，试试1-1.2ul；如果以上方案还不能解决，就要检查你的模板、引物和taq，重新提模板、重新稀释引物，以及用新的pcr试剂。若有疑问，欢迎继续讨论，纯属手打，欢迎采纳，祝实验顺利！
PCR过程中目的条带不够亮，是什么原因 PCR条带不够亮，说明扩增效率不高.一方面可能是你的引物设计的不够好，导致扩增效率低；二是引物的退火温度，你可以做个温度梯度PCR摸索下最佳退火温度，这样可以提高引物扩增效率.三是，DNA模板，浓度过低条带暗，浓度过高，PCR反应会受到抑制，扩增效率不高，或是你提取的DNA纯度不高，含有杂蛋白同样是导致扩增效率不高，条带不够亮的原因.
