蛋白的表达与纯化 蛋白表达纯化已经2113是非常经典简单的实验了，没有5261LSS说的那么吓人4102。说说我的蛋白表达纯1653化以及下面的单抗制作工作总体设计概要吧：1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列，查阅相关文献，看目的基因在那些细胞或者组织中高表达，进而设计该基因的引物，扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取2 构建表达载体：根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达，这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒，导入表达系统中。一般原核表达时间短，成本低，表达量大，常优先考虑；但是有些基因在E coli中就是表达不出，可能是密码子优化等出现问题，也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑（原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好），有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。（我手里就有相关资料，因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备），这一步再强调一下，优化密码子对于蛋白的成功表达很重要3 载体构建好了，下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂，诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题，即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下，取菌体上清（分泌型）或者破碎细胞（胞内表达的蛋白）电泳，。
最常用的真核细胞表达载体有哪些？各在哪些细胞中表达？ 真核细胞常见表达载体1.pCMVp-NEO-BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.2.pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制.3.pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制.
免疫组化中为什么胞浆胞核均染色 免疫组化中，所染色的蛋白的位置与该蛋白的特性有关系。在现有所研究的蛋白中，不少蛋白存在核转位的情况，也就是说当细胞培养的环境或者刺激的因素不同，该蛋白会出现从胞浆到细胞核的表达位置的改变。有时候表达不变仅仅是从胞浆转位到细胞核，有时候还伴有表达的上调，比如nf-kb。第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻（cyanobacteria）中提取的触角光合色素（photosynthetic antenna pigments）。这些生物大分子都含有多种胆汁三烯生色基团（bilin chromophores）。
做免疫荧光怎么看蛋白是在细胞核表达还是胞浆表达 复染细胞核百，常规用过的是DAPI进行细胞核复染（蓝色）。目的是为了鉴别目的蛋白的位置度是胞核表达，还是胞质表达或胞膜表达。一般来讲，如果是胞核表达，会和蓝色问的细胞核颜色重叠；胞质或胞膜表达则不会重合，单独看目的蛋白的表达，会看到有个黑色的空洞的，尤其细胞答图像更为明显。从楼主的图片看，貌似是在胞核表达（因为红色和绿专色都很弱，在胞质没有看到，相反却和胞核重合了）属染色质量需要进一步提高。
western blot 内参 actin 是43还是45 kda 一、为什么要使用内参呢？Western blot除了能证明某样品含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。即为蛋白表达水平最直接的证据。要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。然而如果仅将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法，显然是不可取的。首先各种蛋白质浓度定量方法都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一些列干扰Lowry、BCA反应的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相溶，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。在Western Blot中使用内参。
srsf2基因表达的是胞浆蛋白还是核蛋白ripa裂解液对核蛋白的提取好点。加到细胞培养皿里面，摇15分钟，然后刮下来吸出来，是做western的话加Loading buffer 再95°煮10分钟。裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。
免疫荧光做出来的胞浆蛋白为什么在胞
最常用的真核细胞表达载体有哪些？各在哪些细胞中表达？ 真核细胞常见表2113达载体1.pCMVp-NEO-BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子5261量为6600碱基对，主要由CMVp启动子4102、兔β-球蛋白基因1653内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。2.pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。3.pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
western-blot什么蛋白的表达在胞浆 表达在胞浆中的蛋白千千万万种，主要看你的实验目的是什么，做什么病理实验，需要检测什么“通路”，每一种信号通路有几百到上千蛋白，我看见你的问题，表示无语中…细胞学，生化，没学过，基础知识，基础常识没有，做WB 呵呵呵呵呵…
