每个6孔板平板克隆接种多少细胞 常用的细胞克隆化方法有哪些

悬浮细胞做MTT时接种密度多少为宜呢 如果细胞生长良好25000-30000就可以,你的接种密度不算太高 我养的悬浮细胞在密度为40000的时候,测出的OD值太高常用的细胞克隆化方法有哪些 克隆化培养方法1．有限稀释法克隆培养通过有限稀释，使细胞密度低至一定程度再接种培养在适宜于单细胞生长的培养液中，形成单独的细胞克隆。细胞克隆是指1个细胞来源．经过细胞分裂形成独立的细胞集落。此法进行的克隆化培养，建议使用平底96孔细胞培养板。接种密度控制在10~200个／ml。在计数准确，细胞活性正常的情况下，一般稀释为20个／ml，每孔接种200μl，这样每孔落人细胞数平均为1，获得单克隆生长孔的概率最大，数量最多。有些细胞的克隆化培养效果不理想的原因与它们在低密度下没有能力生存有关。要使细胞在克隆化培养环境下低密度目标细胞能正常生存，可以模拟高细胞密度的环境，就是让目标细胞在含饲养细胞的培养体系中培养。饲养细胞是一类不能连续分裂的细胞，或者说是一类不能长期存活的细胞，一般存活不超过1~2周。在小鼠杂交瘤细胞做克隆化培养时，通常建议使用健康小鼠的腹腔细胞做饲养细胞，使用时，调整饲养细胞在培养体系中的密度为2~4×104个／ml。另外，也有使用小鼠肾细胞做饲养细胞的例子。2．琼脂中的克隆化培养在铺有底层琼脂的培养孔中进行，由于琼脂凝胶的稳定性使得子代细胞不容易脱落细胞集落。温度高时琼脂呈液态，37℃时成凝胶96孔板一般接种多少间充质干细胞 总结下各种孔板细胞接种量 仅供参考细胞培养瓶（板）生长面积容量与细胞数（大约）96孔板 4~5X10 4 35mm培养皿 1X10 6 48 孔板 1.3X10 5 平板克隆形成和软琼脂克隆形成的区别？ 细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。平板克隆形成和软琼脂克隆形成主要是实验步骤和方法的区别和适用情况的区别。平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成单克隆抗体的两次筛选剂 以及原因 A 第一次筛选的原理与方法：第一次筛选是杂交瘤细胞的选择性培养。采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）,其依据是细胞中的DNA合成有两条途径(D途径和S途径），在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。B 第二次筛选的原理和方法:通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞细胞 在96孔板 怎么 挑取单个克隆细胞 无限稀释法，就是铺到96板的一个孔，然后倍数稀释下去，到最后就会有一个细胞的孔，还有就是细胞计数，然后再铺96孔，也会出现一个细胞，但是对于挑单克隆来说，我觉得没如何构建稳定细胞株？ 构建方法：先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，就行成了稳定表达的细胞株。细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finite cell line)，如可以连续培养，则称为连续细胞系(continuous cell line)，培养50代以上并无限培养下去。细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。扩展资料：一般流程1、筛选浓度测定：以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；2、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖；3、细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6）；4、利用质粒如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养 融合后的细胞经过hat培养基选择后，只有杂交瘤细胞2113可以存货5261。但是，选出的杂交瘤细胞不一定就是能分泌研4102究者所需特定抗体的杂交瘤细胞。未将这些具有不同抗原特异性的杂交瘤细胞逐个分离，目前可用的方法有：有限稀释法、显微操作法、半固态凝胶介质中培养并挑选克隆及荧光激活细胞分选仪等，其中常用有限稀释法来选择。该方法是将杂交瘤细胞，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培1653养让其增殖。在对各孔上清液中细胞分泌的抗体进行检测。如果某孔内上清液中的抗体可与特定抗原结合，则定为阳性孔。但是，阳性孔中的细胞不能保证是单细胞，可能既有能产生特定抗体的杂交瘤细胞，又有其他杂交瘤细胞。对此，要挑选阳性孔中的细胞继续进行有限稀释。一般要进行3次~4次，直到确定每个孔增殖的细胞为单克隆细胞。此过程为克隆化培养。一旦获得所需要的杂交瘤细胞系，即用组织培养法和活体法对其进行扩增后，在196℃的液氮中长期冻存，随时取用。细胞平板克隆形成实验培养基要加双抗吗 可以不加，有时候加2113了会有拮抗5261作用。1）24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以4102进行后续的1653梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day0：24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及细胞克隆形成实验试验步骤 细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状

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