双荧光素酶在miRNA验证其靶基因方面的原理是什么？ 荧光素报道基因和双荧光素报道系统

双荧光素酶报告基因一定要在工具细胞上做吗 报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)紧急求助，关于双荧光素酶报告基因实验中细胞裂解问题(minimalTA viral promoter)的萤火虫荧光素酶报告系统载体中,构建得到TOP-Flash从而消除细胞活力、转染效果、裂解效果双荧光素酶报告基因系统promega 多少钱 免疫沉淀 当然，确定miRNA与mRNA之间的互作，我们还有更直接的方法，那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗体进行免疫共沉淀（co-IP）。生物通 目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。生物通 整个过程大致如下：1.创建miRNA模拟物。生物通 2.将紧急求助，关于双荧光素酶报告基因实验中细胞裂解问题 1.两者的结果检测方法不同.GFP绿色荧光蛋白,很直观,能够直接检到荧光,在普通的细胞培养条件下都能够观察到,对细胞的生命活动和其他并行的实验安排影响很小.荧光素酶报告基因使用起来比GFP多一个步骤,因为荧光素酶是个酶,不发荧光,发荧光的是它的底物,荧光素.荧光素在细胞里（要说萤火虫细胞我就不知道了哦）是没有的.所以检测荧光素酶的通常步骤是裂解细胞,释放荧光素酶,与荧光素及其他所需化学物质混合,才得到荧光.现在虽然也有活细胞内检测荧光素酶的手段,但要将荧光素送入活细胞,本身就已要对细胞进行相当的干扰.所以一般来说荧光素酶实验的同一批细胞不适合再做其他并行实验.2.两者的结果含义不同.GFP如果说是定量检测表达蛋白的话,这个定量只能够指,表达的细胞是多少个,不表达的细胞是多少个.GFP对于单个细胞来说,就有阳性和阴性两种结果罢了.GFP不能够定量地告诉你,这个/群细胞里的表达量是多高还是多低.荧光素酶就能够定量地得到表达量/表达水平的数值,但这个数值是相对于一群细胞来说,而不是对于单个细胞.所以荧光素酶常常用来研究启动子的功能与调控,因为启动子对基因表达的调控可以是渐变的,而不是简单的开和关两种状态.全长启动子双荧光素酶报告基因活性比空载载体和阳性对照组活性低，是否说明启动子片段找错了 转录因子是一种具有特殊5261结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件4102，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启1653动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其专它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光属素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。求助双荧光素酶报告基因载体 双荧光素酶报告基因载体 报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素荧光素酶报告基因的应用原理 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。紧急求助，关于双荧光素酶报告基因实验中细胞裂解问题 (minimalTA viral promoter)的萤火虫荧光素酶报告系统载体中,构建得到TOP-Flash从而消除细胞活力、转染效果、裂解效果等系统误差(同双荧光素酶报告基因检测系统)荧光素酶报告基因的技术流程 （1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4）扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。（5）培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。（8）加入底物，测定荧光素酶的活性。（9）计算相对荧光强度，并与空载对照比较。双荧光素酶在miRNA验证其靶基因方面的原理是什么？ 双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于 miRNA 靶基因验证。miRNA 主要通过作用于靶基因的 3’UTR 起作用，可以将目的基因 3’UTR 区域构建至载体中报告基因 luciferase 的后面，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映 miRNA 对目的基因的抑制作用，也即用荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。