Western-blot操作步骤 转膜液能配成五成么

分子量120kDa，转膜条件求助 我用的是湿转，我跑分子量130的。没有加SDS。用的是PVDF膜，甲醇活化一般只用半分钟到一分钟，就放入去离子水中泡着待用了。转膜时，是恒流300mA，基本就转1.5-2h。一般没问题的呀。我觉得你检查一下你的转膜缓冲液（我一般不重复用），还有就是铺膜有没有气泡。另外实在找不到原因可以适当延长转膜时间，但也不可以太长。其实120KD转两小时足够了。另外，我有时封闭后也会marker看不清楚，影响不大，只要还能辨别marker的条带就ok了。求western blot 电泳液和转膜缓冲液的配方~有的转移缓冲液加SDS有的没加，是为什么呢？ 我们实验室用的是：5*SDS-PAGE电泳缓冲液 0.125M tris 15.1g，1.25M glycine 94g，0.5%SDS 5.0g，加入800ml去离子水，搅拌溶解.加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存.用的时候稀释成1*的就可以了.转膜缓冲液的配制方法.关于小分子蛋白的Western-blot问题，实验时的胶浓度，电压，转膜条件等等 我最小也只做过十几KD的。但是根据原理呢主要有以下注意事项：1。当然是胶的浓度。9kda的话要适当增大，15-20%应该差不多吧。如果实在不行还能考虑用gradient gel。2。二是转膜缓冲液，内要含20%甲醇，新鲜配制，反复使用的话注意甲醇会蒸发掉。如果连续使用的话两三次应该还可以。甲醇一是能够洗掉跑胶时泡透了的SDS(SDS使蛋白带负电，方便移动)，二是帮助蛋白固定到膜上面。它同时有收缩胶的孔径的副作用，但对小分子无影响。3。三是膜的孔径。很多常规的膜孔径为0.45um。你如果做小分子，17kd以下都跑掉了，那你应该试试0.2um孔径的膜。有一个小诀窍是转膜时叠两张膜一起转，如果小分子蛋白跑过了前面一张膜，那总还有可能被后面一张膜抓到。4。四是转膜时间。小分子的话就不要过夜转，采取100V一小时应该就可以了，注意降温。Western-blot操作步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)使用细胞。求助缓冲液配方求助Gly 一，分组实验对象：A549细胞干预措施：含有0、5000ug/ml茶氨酸的细胞培养液分组：8个组别，即对照组，5000ug/ml茶氨酸培养15min、30min、1h、2h 6h、12h、24h组。二，实验试剂5X电泳缓冲液；tris 15.1g，glycine 94g，SDS 5.0g，加入800ml蒸馏水，搅拌溶解。加蒸馏水将溶液定容至1L后，室温保存。用的时候稀释成1*的就可以了。10*TBS缓冲液；tris 24.2g，NaCl 80g。加蒸馏水将溶液定容至1L后，调PH7.6，室温保存。用的时候稀释成1*的就可以了。5X转膜缓冲液配制：Gly 14．4g、Tris-base 30g、SDS 1.875g，加蒸馏水至1000ml，4℃保存。1X转膜缓冲液配制：200mL转膜缓冲液母液（5X）+200mL 甲醇＋600mL 蒸馏水封闭液配制：1*TBST 缓冲液 95ml 脱脂奶粉5g，4℃保存，一周内使用。5X加样缓冲液：1.0 mol/L Tris缓冲液1.25ml，甘油4ml，SDS 0.5g，巯基乙醇250ul，溴酚蓝25mg，H2O定容至5ml混匀备用。按1：4比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮10min混匀后再上样 1.0 mol/L Tris缓冲液：Tris 12.114g，H2O定容至100ml.PH 6.81.5 mol/L Tris缓冲液：Tris 18.17g，H2O定容至100ml.PH8.8 10%sds：Sds 10g H2O定容至100ml.分子量120kDa，转膜条件求助 我用的是湿转，我跑分子量130的.没有加SDS.用的是PVDF膜，甲醇活化一般只用半分钟到一分钟，就放入去离子水中泡着待用了.转膜时，是恒流300mA，基本就转1.5-2h.一般没问题的呀.我觉得你检查一下你的转膜缓冲液（我一般不.

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