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dna聚合酶活性测定 DNA聚合酶1和DNA聚合酶III有什么区别

2021-04-28知识17

DNA聚合酶具备几种活性?用途是什么? [1]聚合作用:在引物RNA'-OH末端,以dNTP为底物,按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去,就是DNApolⅠ的聚e68a843231313335323631343130323136353331333330353437合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后,可能使酶的构象发生变化,促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点,则不能与模板配对,无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。[2]3'→5'外切酶活性─校对作用:这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时,由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象,从而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用,这表明温度升高使DNA生长链3'末端与模板发生分离的机会更多,因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP,而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制,并继续进行DNA的合成。由此推论,3'→5'外切酶活性的主要功能是校对作用,当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3'→5'外切酶切除,以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。。

DNA聚合酶的举例 大肠杆菌DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ,DNApolⅠ)这是1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶,又称Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。⑴理化性质:纯化的DNApolⅠ由一条多肽链组成,约含1000个氨基酸残基,MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个-SH基。通过二个酶分子上的-SH基与Hg2+结合产生二聚体,仍有活性。每个酶分子中含有一个Zn2+,在DNA聚合反应起着很重要的作用。每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子,每个分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。经过枯草杆菌蛋白酶处理后,酶分子分裂成两个片段,大片段分子量为76KD,通常称为Klenow片段,小片段的分子量为34KD。此酶的模板专一性和底物专一性均较差,它可以用人工合成的RNA作为模板,也可以用核苷酸为底物。在无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。DNAPolⅠ在空间结构上近似球体,直径约65A。在酶的纵轴上有一个约20A的深沟(cleft),带有正电荷,这是该酶的活性中心位置,在此位置上至少有6个结合位点:[1]模板DNA结合位点;[2]DNA生长链或引物结合位点;[3]引物末端结合位点,用以专一引物或DNA生长链的3'-OH;[4]。

DNA聚合酶的主要活性是什么? DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性

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