WB实验基本步骤 最低0.27元开通文库会员，查看完整内容>；原发布者：梨子小麦实验基本步骤提取细胞蛋白↓BCA定量↓制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）↓蛋白样品变性↓电泳↓转膜↓封闭↓一抗↓TBST洗涤↓二抗↓TBST洗涤↓显影↓结果分析试剂配制1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L磷酸二氢钾0.24g磷酸氢二钠1.44g氯化钠8g氯化钾0.2g加入500ml纯水，调PH=7.2定容至1L，高压蒸汽灭菌2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）500mlPBS+0.25ml吐温-203.电转液500mlTris1.5g甘氨酸7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷4.电泳液（1X）10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水5.TBS6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-207.封闭液TBST1X+5%奶粉40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热WB实验一、蛋白样品制备准备：一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4℃预冷1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2.加入1ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃，8000r离心5min，然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。3.按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液。
wb实验中为什么一定要用到内参抗体 要验证一个基因的表达产物是否正确，童鞋们首选方法是WesternBlot。主要在于WB的操作相对简单方便，不仅仅是可以定性，也可以知道目的蛋白量的相对变化。。
在做wb实验中，tris-triton，NP-40，RIPA，有什么作用？ western blotting的Lysis buffer，是裂解细胞提取蛋白用的裂解液.SDS是十二烷基硫酸钠，RIPA裂解液组成：50 mM Tris-HCl(pH 7.4，三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，150 mM NaCl，1%NP-40，0.1%SDS（不同公司的配比不同，有用Tris-hcl PH=8.0的，加0.5%的去氧胆酸钠）NP-40（Tergitol-type）是很温和的去垢剂，主要用于全细胞蛋白的提取，全称乙基苯基聚乙二醇-40.tris-triton组成：10 mM Tris，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1%Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），10%的甘油，0.1%SDS，0.5%deoxycholate（脱氧胆酸盐）.
