看家基因GAPDH作为引物进行PCR,电泳检测有两条带，杂带大致出现在400bp，请问是咋回事！

请问我在做荧光定量pcr的时候内参的ct值很低大约在35左右，而目的基因ct值在25左右 有哪位高手能指点一下 你选了个什么内参，表达量如此之低？感觉有点问题，检查一下融解曲线对不对。如果是正确的，说明你的目的基因表达量比内参高出一千倍啊。Ct值越大，表达量越低。什么事管家基因？怎么用？内参基因又是怎么回事？ 内参基因 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。在进行基因研究的过程中，实时反转录 PCR也和传统的mRNA定量方法如 Northern b lot技术等一样，要求使用参照基因以校正转录效率和 cDNA用量，弥补制备过程中样本纯度和浓度的差别，使不同样本之间目的基因的比较成为可能，以期获得真实可靠的结果。大多数分析方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。最普通的内参照是内源性参照基因，也叫管家基因。管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是 为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或。看家基因GAPDH作为引物进行PCR，电泳检测有两条带，杂带大致出现在400bp，请问是咋回事！ 你模板是什么？实时定量数据处理时对照组的基因相对表达量怎么计算？ 如何通过荧光定量目的基因和GAPDH计算相对表达量内参就是一个表达量在各个组基本保持不变的基因，又叫看家基因，比如常用的GAPDH，actin。或者18s rRNA也可以。如果内参表达量一致，说明你PCR的上样量一致，样本的质量也一致。如果出入很大，说明你的样本的浓度或者是质量有问题。测到的目的基因的表达量就不可靠了管家基因是用来定量的。用来计算相对表达量。管家基因在相同量样品中的表达量我们认为是一致的。然后根据这个量来计算你的基因在不同样品中的表达量。所以每一个都需要单独的样品。基因组干扰需要你在提取RNA以后用DNase处理样品。如果不放心，可以拿处理过的RNA做膜版，跑一次，如果有带就是有污染，如果没有可以合成cDNA库了。

#基因合成