利用PCR技术扩增目的基因时，引物Ⅰ和引物Ⅱ是相同的吗？ 不相同，而且是从根本上就不同，即序列不同.PCR扩增是一段目的基因，”目的“的意思就是指定的序列，指定的方法就是前后各用一条引物定位.所以两条引物一般称为”上游引物“和”下游引物“.两引物分别对应不同的序列，中间就是需要扩增的部分.
PCR技术获取目的基因时为什么要至少经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因 一般需要获得的基因是有一定长度的，而模板长度很长.设计的引物决定了扩增产物的长度.第一个循环，引物与模板互补，此时变成两个模板，但因为模板很长，没有什么终止扩增，所以第一个循环扩增出来的新片段很长很长.第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因.第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，所以当第三个循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因了.所以至少要3个循环才能分离出目的基因.
对于一段有重复序列的片段如何扩增，只是一个基因的中间的部分序列，准备扩增做overlap。 1.如果是非特异性扩增引起的无法扩增目的条带，那么可以提高退火温度，或者换酶，或者先切胶回收较浅的目的条带，再次扩增2.如果退火温度太高，可以用两步法扩增3.如果引物。
