什么叫做半定性，什么叫做半定量 半定量是RT-PCR做基因表达分析的一种方法，其操作的方法是在野生型和突变体中用一个看家基因（通常是actin）做参照标准来观察目标基因在。
半定量RT-PCR和定量RT-PCR的区别 半定量RT-PCR与定量RT-PCR的区别是半定量RT-PCR操作简便，可快速推测样品中特异mRNA的相对数量；而定量RT-PCB可实时定量，较半定RT-PCB更准确。半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction，SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。定量RT-PCR（quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction，qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
RT-PCR的原理是什么？有何用途？ 原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。扩展资料反转录酶的选择1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适。
real time PCR看家基因的选择重要吗
RT-PCR是，内参是什么时候加入，作用是什么？谢谢 你说的应该是realtimepcr吧，注意rt其实是逆转录reversetranscription的缩写，和realtime一定要分开来。常说的qpcr，qrt-pcr，都是通过实时（realtime）的方法，测定样品中某个模版的起始量ct值但是呢，由于之前rna提取、反转等步骤，各个步骤存在不同的效率，ct值并无法真实反应样品中模版的绝对量，因此，需要一个内参来做为参考。比方说，a基因的ct值，在a样品中是18，在b样品中是20，由于ab样品存在rna质量等等一系列不同，你无法直接就判断这个基因在a样品中的表达量是b样品的4倍。这时候，我们需要一个内参，假如内参ct值在a样品中是14，而在b样品中是15。由于内参的稳定性，在不同样品中被认为是表达量一致的，因此，a基因的在ab样品之间的-δδct值是1，也就是表达量为2倍的关系。这里，我们可以知道内参的作用，即通过测量内参，可以在后面分析过程中将不同样品的起始量均一化。内参需要选择在不同样品中有稳定表达量的基因，这就是为什么内参经常选择看家基因的原因。以小鼠为例，常用的内参有actingapdhhprt等等。当然，现在的很多观点认为这些基因在不同组织中丰度也不同，例如gapdh，在线粒体含量高的组织中丰度高，很多人认为用基因组dna做。
RT-PCR 看家基因（HGAPDH）循环数问题 RT-PCR看家基因（HGAPDH）循环数问题最近一直在做RT-PCR用的看家基因是HGAPDH。但做出来的CYCLENUMBER数值总是出现波动，有时候是14？
