乙肝病毒（HBV）聚合酶很难得到充分的表达和纯化，这也是长期以来阻碍基于该聚合酶性质的抗HBV药物产生。目前为止，全球还没有一个有效的系统被开发出来，用于药物筛选以应对乙肝病毒聚合酶。2020年7月31日，日本大阪大学医学研究生院微生物和免疫学系病毒学科科学家Eriko Ohsaki和Keiji Ueda开发了高纯度HBV转录酶活性区的筛选及其应用。
乙肝理想靶点工具，日本科学家开发，高纯度筛选抗HBV药物系统
这项新技术发表在科学杂志《Viruses》，归属抗病毒药物和疫苗部分。日本科学家介绍，我们成功地获得了一个具有模板/引物和底物结合活性的聚合酶逆转录酶（RT）结构域，并利用纯化的RT蛋白，建立了一个新的高通量筛选（HTS）系统来寻找新的聚合酶抑制剂。为了检验检测系统是否提供可靠的结果，日本科学家使用药理活性化合物，对小规模筛选进行了测试。
因此，试点筛选主要确定了已知的抗病毒聚合酶试剂。然后，再筛选了2万种化合物，新鉴定出4种。其中一些化合物不仅可以抑制HBV-RT底物和/模板/引物结合活性，而且抑制具有延伸活性的Moloney小鼠白血病病毒RT活性。最后，这些候选者甚至在基于细胞的分析中，也显示出了有效性。简单的讲，7月31日发表在Viruses揭示了，日本科学家为寻找乙肝病毒候选抑制剂，提供了一个有用的工具。
为什么需要开发这种制备药物开发新技术？高纯度HBV转录酶活性区的筛选和应用对目前慢性乙肝治疗有什么帮助？在解释这些问题前，我们先来了解，全球乙肝现实状况。在本研究中，日本科学家Eriko Ohsaki和Keiji Ueda解释，乙肝病毒是人类肝硬化和肝细胞癌的主要危险因素。全球约有20亿人感染乙肝病毒，3.5亿人属于慢性乙肝病毒感染。
虽然疫苗接种和抗乙肝病毒药物，如干扰素和核苷类似物可用于预防和治疗，但它们的疗效有限，经常会引起严重的副作用。因此，从慢性感染患者身上清除乙肝病毒是一个相当严重和困难的问题。此外，由于乙肝病毒特有特点，即使从急性感染的病人身上，也几乎不可能消除乙肝病毒。毋庸置疑，乙肝病毒的聚合酶是抑制病毒基因组扩增的理想靶点。
在以HBV聚合酶为靶点的药物开发中，控制感染患者的病毒剂量以防止疾病发展是非常重要的。在最近一项研究表明，非核苷酸逆转录酶抑制剂（NNRTI）和核苷酸逆转录酶抑制剂（NRTI）的药物组合，对甚至多个NRTI耐药的HIV-1菌株，都表现出更强的协同抑制作用。然而，目前还没有针对HBV的NNRTI，因此开发新型NNRTI是一个重要的课题。
最近，日本科学家Voros和他的同事，提出了一种有效策略来纯化重组乙肝病毒Pol结构域，并进行结构和生物物理特性鉴定。然而，要获得足够量的高纯度、全长的HBV-Pol仍然是极其困难的，这就导致了检测HBV-Pol活性的系统相对匮乏。在这项研究中，日本科学家的目的是，建立一个高温超导系统来筛选新的聚合酶抑制剂。
为此，日本科学家尝试使用大肠杆菌表达系统表达和纯化HBV-Pol（HBV-RT）的逆转录酶（RT）结构域，并成功获得高纯度的RT蛋白。纯化的RT蛋白与模板/引物（T/P）和底物具有特异的结合活性，但没有表现出任何聚合活性。利用纯化后的蛋白建立检测HBV RT的T/P和底物结合活性的检测系统。不同物种间的T/P和底物结合域的功能和结构高度保守，T/P和底物结合是聚合酶反应的第一个基本步骤。利用目前的系统，日本科学家从制造商（LOPAC?；Sigma，St.Louis，MO，USA）和大阪大学药物发现、设计和开发中心筛选了一个化学库。
从制造商的库中鉴定出棉酚、苏拉明和NF023等化合物。从大阪大学化学图书馆，获得了四个能够抑制RT特异性T/P和底物结合活性的化合物。为了评价hit化合物对HBV-DNA复制的抑制作用，还用一株HBV产生细胞系、HB611和NTCP表达的HepG2细胞系进行细胞检测。最终，利用这些发现并建立了目前筛选抗HBV药物的系统，并能够找到几种HBV RT的候选抑制剂，而其中一些先前被认为是抗病毒聚合酶试剂（2020年7月31日 Viruses 日本大阪大学医学研究生院微生物和免疫学系病毒学科 Eriko Ohsaki、Keiji Ueda）。
