求助：原核表达目的蛋白胞内发生降解 应该是原核表达宿主菌比较准确 原核表达宿主菌之前可以表达蛋白，放一段时间不表达蛋白原因很多 首先要确认其他条件是否也有改变，比如其他基因，质粒载体，表达条件等等 原核表达宿主菌保存条件没有控制好可能导致宿主菌退化，被污染等等，结果。能抑制多长时间你需要自己检测。不同细胞、不同siRNA、不同转染试剂都会影响效率。但是假设你转染之后48小时或者72小时之后passage 细胞做MTT或者克隆形成实验，个人觉得是可以的（前提是你有48小时或72小时knockdown证据）。
最常用的真核细胞表达载体有哪些？各在哪些细胞中表达？ 真核细胞常见表达载体1.pCMVp-NEO-BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.2.pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制.3.pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制.
真核表达系统与原核表达系统的异同？ 真核表达系统和原核基因表达调控的相同点：1、真核基因与原核基因的调控一样，都是以转录水平调控为最重要；2、结构基因均有调控序列，并依靠特异蛋白因子与这些调控序列的结合与否调控基因的表达；3、都要经历转录、翻译过程；4、表达过程都有复杂性、多环节。真核表达系统和原核基因表达调控的不同点：1、真核基因表达调控过程更复杂；2、在染色质结构上，原核细胞的DNA是裸露的，而真核细胞DNA包在染色体中；3、在原核细胞中的染色质结构对基因的表达没有明显的调控作用，而在真核细胞中染色质的变化调控基因表达，并且基因分布在不同的染色体上，存在染色体间基因的调控问题；4、真核生物中编码蛋白质的基因通常时断裂基因，含有非编码序列，即内含子，因而转录产生的mRNA前体必须剪切加工才能成为有功能的成熟的mRNA，而不同的拼接方式可以产生不同的mRNA。而原核生物的基因由于不含有外显子和内含子，因此，转录产生的信使RNA不需要剪切、拼接等加工过程；5、在原核基因转录的调控中，既有正调控，也有负调控，二者同等重要。而真核细胞中虽然也有正调控成分和负调控成分，但目前已知的主要是正调控，且一个真核基因通常都有多个调控序列，必须有多个激活物。
原核表达载体和真核表达载体的区别 一、表达载体2113不同：原核表达载体构建重5261组表达载体：41021、载体酶切：将表达质粒用限制性内1653切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。真核细胞表达载体之一为pEGFP-N1载体，具有对方面的优点。pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因。二、表达实现方式不同：原核表达载体测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。真核表达载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。三、获得目的基因方式不同：pEGFP-N1载体从结构上看，质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是真核细胞表达载体保证目的基因稳定表达的因素之一。原核表达载体获得目的基因：1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因。
真核原核表达系统的优缺点？ 原核表达系统表达调控2113方式组成型，诱导型表达产物5261定位分泌型，不分泌型(细胞内4102，细胞膜，周质1653空间)产物纯化方式是否融合蛋白，是否一步亲和纯化产物溶解状况可溶，包含体，分泌型在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制②能诱导基因高效表达，可达。
真核过表达质粒，原核过表达质粒的区别~急求~~ 一、指代不同1、真核过表达质粒：真核细胞表达载体之一为pEGFP-N1载体，具有对方面的优点。pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因。2、原核过表达质粒：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行表达的载体。二、特性不同1、真核过表达质粒：该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是真核细胞表达载体保证目的基因稳定表达的因素之一。2、原核过表达质粒：启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。向左转|向右转三、载体构建不同1、真核过表达质粒：，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFPGFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。2、原核过表达质粒：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。参考资料来源：-原核表达载体参考资料来源：-真核。
真核表达蛋白是分泌表达还是胞内表达 一般的话，原因答题是可以分为两种：①不表达，从基因上开始分析，无论是用那种宿主表达蛋白，真核表达或是原核表达，都要考虑到基因优化的层面，如果基因本身不适在此系统中表达，那么下游在怎么优化也是不表达的②表达条件的优化，转染效率是否转染成功，细胞培养细胞生长的状态，这些条件是可以通过自己优化解决的此外，真核细胞蛋白表达，载体的选择是很重要的，因为利用哺乳动物细胞表达蛋白，你是用的是瞬时转染表达技术，瞬转效率本身也不高，1mg的质粒摇1l也就能得到1mg左右的蛋白，所以载体的选择很关键。
真核细胞表达和原核细胞表达有什么不同？他们表达产生的活性蛋白有什么不同？希望能够详细一点解答！ 首先得从细胞的结构说起：真核细胞具有各种胞内细胞器，而原核细胞却除核糖体之外不存在其他细胞器。这与基因的表达是密不可分的。真核细胞的基因是有外显子和内含子组成的，而原核细胞却无此之分。在细胞内DNA进行转录是都是从启动子开始，按照碱基互补配对原则依次进行。只是翻译产物会有所不同，真核细胞的翻译初产物，需要进行进一步的加工修剪，这就用到了内质网和高尔基体，通过细胞器的加工可以将内含子的翻译产物去掉。而原核细胞就简单的多了，只要按部就班的来就行，不需要修饰。鉴于两者的不同，在做基因工程的时候原核细胞的DNA一般可以通用，而真核细胞DNA则必须进行修饰。
真核目的基因在原核细胞中表达的要求是？ 真核细胞和原核细胞 的DNA 有编码区和非编码区 组成。但是 真核细胞的DNA中的 编码区 中又有 内含子和外显子。外显子 是可以 转录翻译的。内含子是控制转录翻译的。而 原核细胞却没有 内含子和外显子。它的编码区 是连续的。所以它只能表达连续的编码区，不能表达 真核细胞那 不连续的编码区。所以真核细胞的 DNA要在原核中表达，就只要 外显子 就够了。就要把 内含子 去掉。
