整合子的含义 2 整合子的结构和分2.1 整合子的结构整合子的结构如图1所示，由3个部分组成：5′保守末端(5′conserved segment，5′CS)、3′保守末端(3′conserved segment，3′CS)和两者之间的可变区(vari？able region)。5′CS是整合子的基本结构，包括编码整合酶(integrase，IntI)的基因(intI)、整合子重组位点attI和整合子可变区启动子(Pant)［6］。IntI属于酪氨酸整合酶家族，催化基因盒在整合子重组位点attI和基因盒重组位点attC之间的整合和剪切。整合酶基因带有自己的启动子Pint。attI位于整合酶基因的上游，是外源基因盒整合到整合子上的位点。启动子Pant指导下游可变区中自身不带有启动子的基因盒中基因的表达。启动子Pant的方向与Pint的方向相反。可变区带有不同数量和功能的基因盒，但可变区并不是整合子的基本结构，有的整合子在5′CS和3′CS之间没有基因盒插入［7］。3′CS因整合子的种类不同而异。2.2 整合子的分类整合子常根据intI基DNA序列的不同进行分类，研究较多的主要有以下4类：第一类整合子最常见，从临床菌株中发现的整合子大多属于此类。其整合酶IntI1含有337个氨基酸。5′CS有编码IntI1的基因intI1、重组位点attI1和启动子Pant。其中Pant位于IntI1的编码框。
位点特异性重组的整合 λ噬菌体编码λ整合酶（integrase）。这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组，将两个环状DNA分子变成一个大环。在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。这种作用可用体外模型来进行实验。用四种成份混合起来组成反应系统：纯的整合酶；来自E.coli的一种辅助蛋白，称为整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）；镁离子；和含有噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点（称为attP和attB，att源自attachment）的DNA片段。对于这个DNA片段，一个简单的制备方法就是人工构建含attP和attB两者质粒。当整合反应发生时，即在attP和attB处发生交叉重组，产生两个较小的环状DNA。整合反应由整合酶催化，其步骤是彼此偶联的：四条链同时被切断、交叉和重新连接起来，其间没有发现任何稳定的中间产物。这种前文提到的拓扑异构酶Ⅱ的反应很相似，即DNA双链同时被切断，然后磷酸二酯键又重新连接起来，并不需要ATP供应能量。故整合酶实际上能起拓扑异构酶的作用，可使带有att位点（或类似序列）的超螺旋松弛。并且和拓扑异构酶一样，整合酶也产生交错的断裂（staggeredcut）：。
位点特异性重组的整合酶和IHF 在att上都有特定的结合位点，体外实验也证明这两种蛋白质结合在attDNA的特定位点上。每一次重组过程需要20－40个整合酶分子及约70个IHF分子。故可能这两种蛋白质不仅是作为酶（发挥催化作用），而且在每次重组中都要形成某种复合物结构。通过缺失实验，证明attP至少要约250bp长，太短将使其功能丧失，而attB则较短，包括核心（core）在内约23bp长即有功能。长250bp的整个attP可绕在整合酶分子的周围，类似核小体的结构，其中含有约8个整合酶的单体，每个的分子量约为40000。attB和attP中有相同的15bp的核心序列。整合酶与两个核心都相结合。如果两个核心中有一个的顺序有所改变，则重组的效率将大为降低。但是如果两个核心序列发生了相同的改变，则顺序交换仍能进行。可见整合酶不但要求特异的序列，而且要求两个核心序列有同源性。然而，如果λ前病毒受到诱导（induction），则整合作用将被逆转。此过程称为切出（excision）。切出后，细菌和噬菌体DNA恢复至原来完整状态。前病毒受到诱导时即产生又一种蛋白质，称为切出酶（excisionase）。切出酶和整合酶一起催化前病毒DNA两端的杂种att位点之间的重组。这时，整合酶和切出酶一同紧密结合在细菌前病毒杂种att位点上，显然。
DNA重组的种类、同源重组的基本过程、相关的酶及其功能。1）同源重组：重组酶 同源序列；位点特异性重组：特异性位点，特异性位点的核酸内切酶；转座重组：转座元—返座元。
酶切法原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有。
什么是05噬菌体的位点特异性重组？其在基因工程中的应用入是什么 位点特异性重组系统由介导基因重组的重组酶和相应的特异性位点组成。重组酶是源于细菌或酵母，可识别特异位点发生精确重组的一类酶。根据序列的同源性及催化氨基酸的特性，重组酶可分为酪氨酸和丝氨酸两个家族[2]。重组酶Cre、Flp、R以及Xis均属于酪氨酸家族，loxp、frt、rs和attp为相应的特异性位点，这些特异性位点DNA序列各异，但大体结构相似，一般均由几十个碱基组成，含有一个6～8bp的核心区域和一对反向重复序列。位点特异性重组系统始于对λ噬菌体溶源化的过程研究，之后人们对其他位点特异性重组系统的重组酶、识别位点、重组机理等进行了深入的研究[3-4]。特异性重组系统在控制植物外源DNA序列的整合中有着重要的作用，它能产生基因的定位。
位点特异性重组的机制和原理
由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称（)。 A．位点特异的重组 B．同源重组 C．随机重组 D A
Cre-LoxP重组酶系统的Cre重组酶和LoxP序列 Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环状甚至超螺旋 DNA。它 是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP（locus ofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：5'-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5'
同源重组的转移法 同源重组(homologous recombination)是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导入基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。根据氨基酸序列相似性和催化机制的差异，位点特异性重组酶主要分为两大家族，即整合酶系和解离酶/转化酶系，这两个家族相隔很远。整合酶家族催化重组的机制是进行酪氨酸介导的链交换，该家族包含有Cre/loxP、FLP/FRT等已经研究得比较清楚并广泛应用的重组酶系统。解离酶/转化酶家族催化机制是由丝氨酸介导的，当酶和DNA之间形成含磷的丝氨酸连接时，连接处DNA的4条链发生协调的交错断裂，然后重新结合，完成同源重组。该家族成员包括来自于链霉菌噬菌体的φC31整合酶、lactococcal噬菌体的TP901—1整合酶、放线菌噬菌体的R4整合酶等。中C31整合酶(φC31—int)能够有效介导噬菌体基因组中attP位点与细菌宿主染色体上attB。
