转录组测序得数据怎么判断kegg富集显著性提取样品总RNA后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加A并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeq？2000进行测序。
如何构建CDNA文库？ cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤。
cDNA文库的mRNA 动物细胞mRNA的制备植物细胞mRNA的制备 1、mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统，因为该系统需要制备无细胞提取物，还有人称之为溶胞粗制品翻译系统。无细胞提取物的制备：用机械的，超声波的，渗透压或用适当的去污剂等方法，将细胞溶破，再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶，核糖体，tRNA和能量发生系统.常见的体外无细胞翻译系统：兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核，其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.缺 点：已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+，可很快分解，除去体系中的珠蛋白mRNA。麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎，分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23；将S23分装，保存于-20°C冰箱中.利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时，需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA，所以必须加入mRNA。优 点：适于研究mRNA，活力强，价格低廉等.缺 点：不同制品的活性差别较大，且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译SDS-PAGEanalysis。
真核原核表达系统的优缺点？ 原核表达系统表达调控方式组成型，诱导型表达产物定位分泌型，不分泌型(细胞内，细胞膜，周质空间)产物纯化方式是否融合蛋白，是否一步亲和纯化产物溶解状况可溶，包含体，分泌型 。
RNA的提取方法步骤及原理. RNA抽取一般使用Trizol法抽提：Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理：在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。参考资料来源：-RNA
常用rnase抑制剂是什么 RNase Inhibitor(Ribonuclease Inhibitor)，即RNases抑制剂，是一种大肠杆菌表达的重组蛋白，编码基因来源于人类胎盘素，可以通过非竞争性方式按1：1比例和RNase A、RNase B。
