原标题：可实现受损关节替换的软骨再生3D生物打印
江苏激光联盟导读：
关节软骨是关节中的弹性结缔组织。软骨损伤是非常普遍的现象，但由于软骨的低细胞性和无血管性质，使其自我修复能力有限。软骨损伤是关节功能障碍的常见原因，现有的关节假体还不能与宿主关节组织一起重塑，因此软骨/关节重塑仍然是相当大的挑战。
在临床实践中，使用金属及合成材料假体的全关节置换手术可以取代患有关节炎的关节。因为目前关节假体还不能与周边关节组织一起重塑，并且可能由于无菌性松动或感染而导致长期功能损伤，只能通过关节的生物性再生来解决。2020年9月9日，来自南京医科大学附属第一医院、上海交通大学医学院附属第九人民医院、苏州市立医院北区（南京医科大学附属医院）和东华大学的骨科、转化研究和高分子科学领域的科学家团队在Science Advances上发表了"3D bioprinting dual-factor releasing and gradient-structured constructs ready to implant for anisotropic cartilage regeneration"，使用间充质干细胞(MSC)移植，然后向软骨细胞刺激定向分化已成为软骨修复的首选方法。临床研究表明，关节软骨损伤总是深深地延伸到软骨下骨中，从而在膝关节中引起软骨缺损，这可以改变关节的生物力学特性并影响软骨组织的长期功能，这表明了同时修复膝关节和修复全层各向异性关节软骨的重要意义。
随着关节软骨从浅表区过渡到深层区，软骨的细胞外基质(ECM)沉积和细胞类型中的梯度和各向异性结构可在深区（血管向内生长）提供出色的渗透性，并提供所需的机械支撑。然而，在软骨修复中，开发模仿梯度各向异性结构的仿生构造和不同层中的信号传导方法以诱导区域依赖性软骨形成分化和ECM沉积是非常具有挑战性的。根据之前的科学研究，具有较小孔径（100至200μm）的支架可以更好地促进骨软骨再生中的软骨形成。然而，在这些具有小孔径的支架中，成骨作用和血管生成受到抑制，由于这些支架中的微血管向内生长减少，因此显示出更少的营养物质扩散和更坏的组织整合。在许多研究中已经报道了水凝胶用于软骨再生，但是由于结构完整性、机械稳定性和可印刷性不足，仍然难以用水凝胶构造大规模的组织结构。在这里，研究人员开发了双因子释放、梯度结构的MSC负载结构的3D生物打印，并通过对动物植入建立全层软骨再生进行测试。
图1. 研究设计和支架结构的示意图
△图解：(A)示意图的研究设计与兔子关节软骨再生的3D生物打印的双因素释放和梯度结构的载有MSC的构建体。各向异性软骨支架的结构示意图和研究设计。(B)使用计算机辅助设计（CAD）模型来设计四层梯度PCL脚手架结构，以提供BMS用于各向异性软骨生成和深层营养物供应（左）。梯度各向异性软骨支架是通过一步一步3D生物打印梯度聚合物支架结构和双蛋白释放复合水凝胶与生物墨水构成的，该复合水凝胶将BMSC与BMP4或TGFβ3μS作为BCS封装成软骨细胞（中间）。当移植到动物模型中时，各向异性软骨构建体为各向异性关节软骨的仿生再生提供了BMSC和差异蛋白的结构支持和持续释放（右）。
图2. 用于植入的3D生物打印梯度软骨支架。
△图解：(A)(a)人和(b和c)兔子的软骨支架的总体外观（b，间距为150μm的NG; c，间距为750μm的NG）。在SEM图像上方还显示了兔软骨支架的顶视图(d，间距为150μm的NG; e，间距为750μm的NG; f，间距为150至750μm的梯度支架)(g， 150μmNG支架采用水平截面；h为垂直截面)，以证明印刷支架中PCL纤维的精确对准。(B)解构梯度支架。梯度支架的结构被解构为四层。在每一层中水凝胶-PCL复合结构的微观外观显示出良好的互连性和每一层的精细，有序排列的结构。(C和D)在用活/死测定（绿色，活细胞；红色，死细胞）印刷后，分别在浅层和深层显示出良好的细胞活力(C)在显微镜下和(D)在共聚焦显微镜下。DAPI，4'，6-二mid基-2-苯基吲哚。(E)细胞通过细胞骨架染色在浅层和深层扩散。(F)在浅层和深层中对软骨标志物进行免疫染色。润滑标记的COL2A1和PRG4的表达在具有小孔径的表层(a和b)中显着较高，而深层(c和d)的软骨细胞主要表现为肥大表型。图片来源：南京医科大学附属第一医院。
3D生物打印软骨结构
该团队使用3D生物打印技术开发了用于关节重建的不同关节组织构造。他们通过包括具有多种生长因子释放结构的生化刺激物（BCS）和具有小孔径以诱导软骨形成的生物力学刺激物（BMS）来模仿天然软骨。然后，他们创建了第三个软骨构造作为双重刺激（DS）组，以包括两种形式的刺激。对于生长因子，研究小组在软骨构造中选择了骨形态发生蛋白（BMP4）和转化生长因子β3（TGFβ3）的组合，以再生复杂的不均匀关节组织。然后研究人员开发了可递送生长因子的水凝胶，并使用了聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球作为载体/载体。该团队为BMS（生物力学刺激）组和BCS（生化刺激）组维持恒定的纤维间距，以开发非梯度支架，同时在DS（双重刺激）组中为支架引入逐渐变化的纤维间距。科学家还使用了聚己内酯(PCL)聚合物，并将其整合到仿生支架结构中。通过这种方式，他们开发了使用4 x 4 x 4 mm支架的兔软骨支架和使用14 x 14 x 14 mm支架的人软骨支架。
△使用OPUS系统的3D打印过程显示了水凝胶-PCL图案化和每一层以及整个软骨构造的梯度微通道。来源：Science Advances
为了测试生长因子对骨髓基质细胞孙等在水凝胶中培养骨髓间充质干细胞七天。首先在实验室中释放出持续可控体积的生长因子，然后科学家们在打印的支架上进行细胞存活和增殖试验，以记录生物打印后60分钟(第0天)、7天和21天骨髓间充质干细胞的存活情况。活细胞在第0天显示细胞活力增加，随后从第3天至第21天持续生长。21天后，研究人员注意到支架上良好的三维细胞锚定，并且该工作表明在实验室中为骨髓间充质干细胞生长和分化形成软骨细胞发展了有利的微环境。
软骨植入物在兔膝关节软骨缺损模型中较好的修复效果
研究团队用兔子实验模型测试软骨支架在膝关节修复过程中的能力。他们使用一步三维生物打印来构建支架，以提供结构支撑和细胞的持续释放。实验促进了天然关节软骨的仿生再生，并且与骨形态发生蛋白组和骨桥蛋白组相比，双刺激实验组的植入物在缺损部位显示出更好的整合。该小组用以下仪器监测移植部位磁共振成像24周后(6个月内)关节软骨明显愈合。结果显示，与BCS或BMS动物组相比，DS组的软骨修复和关节管理更好。
图3. 双因子释放和梯度结构软骨支架在兔膝关节软骨缺损模型体内显示出更好的各向异性软骨修复效果。
△图解：(A)在8、12和24周时，支架植入过程和修复软骨的总体外观。对手术的膝关节（第五行）进行了MRI检查，结果表明，对于DS支架移植的关节，软骨下水肿和关节表面（白色箭头）的愈合明显更好。(B至F)通过(B)在体内植入过程中修复的软骨组织的组织学评分评估，比较了支架的软骨保护作用。(C)植入支架的两组患者的(C)Mankin评分和(D)ICRS（国际软骨修复协会）股骨dy（FC）和胫骨平台（TP）的关节软骨组织学评分。土著组和其他组之间的* P <0.05。BCS组和DS组之间的#P <0.05。(A)24周时新软骨组织的组织形态学分析。公关，picrosirius红色。左下面板是彩色方形框中形成的新软骨轮廓的高分辨率图片。图片来源：南京医科大学附属第一医院。
该团队观察了关节软骨从浅层向深层的过渡，并测试了生成的软骨与天然软骨的比较特性。如前所述，与其他组(基底细胞组和骨髓组)相比，支架显示向内生长的微血管生长改善。通过这种方式，研究人员为关节重建、关节软骨再生和功能性膝关节生成了具有结构完整性的3D生物打印各向异性构建体关节软骨兔子模型的构建。3D生物打印的功能性结构在关节置换过程中充当假体软骨修复愈合动物模型中受伤或退化的关节。
本文来源：DOI: 10.1126/sciadv.aay1422
